Evaluation of the action of precipitating agents to obtain allergenic proteins from crude mite extracts / Avaliação da ação de agentes precipitantes na obtenção de proteínas alergênicas presentes em extratos brutos de ácaros

Introduction: Allergen proteins found in dust mite extracts, such as Dermatophagoides farinae (DF), Dermatophagoides pteronyssinus (DP) and Tyrophagus putrescentiae (TP), are relevant for scientific studies in the allergy and immunotherapy fields. The precipitation/concentration of protein extracts may favor the aggregation of the allergens in homogenates. Objective and method: This paper investigates the precipitation process by submitting crude mite extracts to compounds such as ammonium sulfate (NH4)2SO4, trichloroacetic acid (TCA) and acetone. Results: The best results were obtained by fractionation with (NH4)2SO4 at 80% (w/v) saturation (~0° C), observing the protein markings on the electrophoresis gel. Major allergens were identified by immunoblot at 25 kDa (cysteine protease) for Der f and Der p; and 25 kDa, 30 kDa (tropomyosin) and Try p 3, near 26 kDa. For this percentage the total protein contents were 12.83 mg mL-1 for Der f, 24.78 mg mL-1 for Der p and 27.35 mg mL-1 for Try. Conclusion: An advantage of precipitation with (NH4)2SO4 over precipitation with acetone was the possibility of gradually obtaining protein fractions, which does not happen when using the latter. The addition of 80% (v/v) acetone to the mite extracts favored total protein precipitation in the concentrations 16.42 mg mL-1, 28.47 mg mL-1 and 13.41 mg mL-1. The use of TCA in concentrations above 20% (w/v) forms peptides that are not retained in the gel under the established experimental conditions, and dilute solutions of this acid are more efficient.

Introdução: As proteínas alergênicas presentes nos extratos dos ácaros de poeira, tais como Dermatofagoides farinae (DF), Dermatofagoides pteronyssinus (DP) e Tyrophagus putrescentiae (TP) são relevantes para estudos científicos na área de alergias e aplicação em imunoterapias. A precipitação/concentração desses extratos proteicos pode favorecer a agregação de alérgenos nos homogenatos. Objetivo e método: O trabalho investiga o processo de precipitação, submetendo os extratos brutos de ácaros de poeira a compostos como sulfato de amônio (NH4)2SO4, ácido tricloroacético (ATC) e acetona. Resultados: Os melhores resultados foram obtidos por fracionamento com (NH4)2SO4 em 80% (m/v) de saturação (~ 0°C), observando as marcações proteicas no gel de eletroforese. Os alérgenos principais foram identificados por immunoblot em 25 kDa (cisteína protease) para Der f 1 e Der p 1; e 25 kDa, 33 kDa (tropomyosin), 11 kDa para Tyr. Para esse percentual, os teores de proteína total foram de 12.83 mg mL-1 para DF; 24,78 mg mL-1 para DP; e 27,35 mg mL-1 para TP. Conclusão: A vantagem da precipitação com (NH4)2SO4 frente à precipitação com acetona foi a possibilidade de gradativamente se obter frações proteicas, o que não acontece quando utilizado esse solvente. A adição de 80% (v/v) de acetona aos extratos de ácaros favoreceu a precipitação total de proteína nas concentrações 16,42 mg mL-1; 28,47 mg mL-1; e 13,41 mg mL-1. O uso de ATC em concentrações acima de 20% (m/v) forma peptídeos que não são retidos no gel nas condições experimentais estabelecidas, sendo eficiente soluções mais diluídas desse ácido.

Study of protein profile and immunochemical reactivity for extracts of D. farinae, D. pteronyssinus and B. tropicalis mites in the city of Rio de Janeiro, Brazil / Estudo do perfil proteico e reatividade imunoquímica dos extratos dos ácaros D. farinae, D. pteronyssinus e B. tropicalis na cidade do Rio de Janeiro, Brasil

Objective: In tropical countries like Brazil, the mapping of protein constituents of mite extracts becomes relevant in the context of therapeutic evaluations of respiratory allergic diseases. In addition, this allows to set up an internal national database of the population's sensitization profile. Extracts are complex mixtures containing different proportions of biological materials, and the determination of their protein profile is necessary for an improved performance in diagnosis and therapy. Therefore, in this study, we used electrophoresis to characterize the protein constituents of B. tropicalis, D. farinae and D. pteronyssinus extracts, and evaluated the reactivity of specific immunoglobulins from atopic volunteers from the city of Rio de Janeiro, Brazil. Methods: Samples of the extracts were subjected to precipitation with acetone and applied to polyacrylamide gel 12.5%. After the electrophoretic run, samples were transferred to a 0.45 µm nitrocellulose membrane, followed by incubation with the serum pool. Bands related to antigenantibody reactivity were obtained by the colorimetric method, using peroxidase conjugated to secondary antibody. Results: The results obtained showed that protein precipitation favored the visualization of bands in the polyacrylamide gel; homogeneity was evidenced by experiment reproducibility and low standard deviation values. With regard to electrophoretic profile, the extracts showed specific proteins in their composition, with positive reactivity to the immunochemical test. Conclusion: One may infer that mite extracts in Brazil present different allergens when compared to extracts described in the American and European literature, warranting the development of new, specific criteria for extract standardization.

Objetivo: Em países tropicais, como o Brasil, o mapeamento dos constituintes proteicos de extratos de ácaros torna-se informação relevante quando se pretende fazer avaliações terapêuticas de doenças alérgicas respiratórias, além de contribuir para a construção de um banco de dados interno do país. Os extratos apresentam-se como misturas complexas contendo diferentes composições de material biológico, sendo necessária a determinação do seu perfil proteico para um melhor desempenho em diagnóstico e terapia. Assim, este estudo analisou a eletroforese das proteínas constituintes dos extratos de B. tropicalis, D. farinae e D. pteronyssinus e avaliou a reatividade das imunoglobulinas específicas de soros de voluntários atópicos da cidade do Rio de Janeiro, Brasil. Métodos: Amostras dos extratos foram submetidas a precipitação com acetona e aplicadas em gel de poliacrilamida 12,5%. Após a corrida eletroforética, as amostras foram transferidas para membrana de nitrocelulose de 0,45 µm, seguido da etapa de incubação com pool de soros. As bandas referentes à reatividade antígeno-anticorpo foram obtidas pelo método colorimétrico, utilizando-se a peroxidase conjugada a anticorpo secundário. Resultados: Os resultados obtidos mostraram que a precipitação proteica favoreceu a visualização das bandas no gel, mostrando sua homogeneidade pela reprodutibilidade dos experimentos e seu baixo desvio padrão. Também quanto ao perfil eletroforético, os extratos apresentaram proteínas específicas em sua constituição, tendo reatividade positiva ao teste imunoquímico. Conclusão: Pode-se inferir que os extratos de ácaros obtidos no Brasil apresentam alérgenos diferentes quando comparados com extratos proteicos apresentados na literatura americana e europeia, o que torna necessária a criação de critérios próprios de avaliação para padronização dos extratos.